實驗動物的麻醉方法主要分全身麻醉和局部麻醉2大類。大多數的動物實驗中，不僅是為了使動物免受痛苦，更為同時保護實驗者免受傷害，通常需要對實驗動物進行全身麻醉，因此所用的藥物也絕大多數選用全身麻醉藥。
全身麻醉主要包括吸入麻醉、注射麻醉和氣管內插管麻醉。動物在全身麻醉前必須進行足以達到空腹的時間禁食和麻醉前1h禁水，不同種類的動物術前禁食時間不同，犬、猴、豬麻醉前禁食8～12h，豚鼠禁食12h，而兔和其他嚙齒類動物不需禁食，大中型禽類(鴨、雞、鵝)禁食6～12h。
1．吸入麻醉 吸入麻醉是將氟烷、甲氧氟烷等揮發性麻醉藥，由動物經呼吸道吸入體內而產生麻醉效果。吸入麻醉通常適用于麻醉時間較短的動物實驗或用作基礎麻醉或注射麻醉的輔助麻醉方法，較容易控制麻醉深度、安全性好。各種實驗動物如嚙齒動物，包括犬、猴等大動物都可采用吸入麻醉。大鼠、小鼠、豚鼠、兔、貓的吸入麻醉一般需借助麻醉罐進行，常用的麻醉罐大多為透明帶蓋的容器，大小根據動物體積而定，將動物放入含有吸附揮發性麻醉藥的棉球或紗布的麻醉罐中，蓋好蓋子，觀察動物的行為，動物即刻出現興奮、繼而出現抑制，隨即自行倒下。豬、犬等大動物的吸入麻醉則需借助合適的麻醉口罩，將加上揮發性麻醉藥的紗布置入口罩內。
2．注射麻醉 注射麻醉法是使用BBT類、LAT、水合氯醛、DXP和速眠新等非揮發性全身麻醉藥注射入動物體內麻醉的方法。注射麻醉方法簡便，麻醉時間較長，更適用于需較長時間麻醉的動物實驗。注射可采用靜脈注射、腹腔注射、肌內注射等途徑進行麻醉。兔、貓、犬、豬、猴等大動物通常采用靜脈注射或肌內注射的方法，而小鼠、大鼠、豚鼠等小動物則常采用腹腔注射的方法，大鼠還常采用尾靜脈注射麻醉。在大動物的靜脈注射麻醉時，不可將藥物一次性快速推入，而是間歇、緩慢推注，達到預定劑量3／4后，更要減慢推注速度，并一邊注射，一邊觀察動物的全身肌松程度，達到實驗所需麻醉狀態時，立即停止藥物注射。
3．氣管內插管麻醉 氣管內插管麻醉是將一市售特制的導管置入動物氣管內，建立人工通氣管，通過這一氣管內導管進行麻醉的方法。主要用于豬、犬等大動物需要長時間處于麻醉狀態的實驗中追加麻醉藥物。此麻醉方法的優點主要在于適合任何手術體位要求，可防止麻醉后的動物因呼吸道阻塞而窒息死亡，使動物保持呼吸道通暢；可防止異物進入呼吸道，也便于清除氣管內的分泌物；便于給氧吸入和輔助呼吸；能主動地對動物重要的生理功能指標進行監測、調整和控制。
局部麻醉雖然在動物實驗中用途不是很廣泛，但貓、犬等大動物短時間內實驗中，在基礎麻醉基礎上可能會使用局部麻醉的方法，較多應用于眼科和耳鼻喉科的黏膜麻醉實驗。局部麻醉是用局部麻醉藥阻滯周圍神經末梢或神經干、神經節、神經叢的沖動傳導，產生局限性麻醉區，常用的方法有表面麻醉、浸潤麻醉、區域阻滯麻醉以及傳導麻醉等。局部麻醉對重要器官功能干擾輕微，麻醉并發癥少，較之全身麻醉安全。局部麻醉藥按化學結構分類，可劃分為酯類和酰胺類2種局部麻醉藥，酯類局部麻醉藥有KKY、普魯卡因、丁卡因和氯普魯卡因；酰胺類局部麻醉藥有LDKY、BBKY、卡博卡因和地布卡因等。
選擇麻醉藥物時還應考慮麻醉藥物對實驗結果的影響，有作者比較硫噴妥鈉-異氟烷(TI)、美托咪定-(MK)和甲苯噻嗪-(XK)3種混合麻醉藥物應用于相同的德國小型犬，在相同的實驗室條件下觀察視網膜電流圖檢測結果，發現硫噴妥鈉-異氟烷明顯干擾了波輻和峰潛時。
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